GLP-1(liên kết:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3}.html) là một hormone polypeptide bao gồm 30 axit amin. Với nghiên cứu chuyên sâu về GLP-1, ngày càng có nhiều phương pháp tổng hợp được phát triển. Bài viết này sẽ giới thiệu một cách có hệ thống các phương pháp tổng hợp GLP-1 đã biết hiện nay.
Phương pháp 1, tổng hợp pha rắn:
Tổng hợp pha rắn là phương pháp được sử dụng rộng rãi để tổng hợp peptit và protein, đồng thời cũng thường được sử dụng để tổng hợp GLP-1. Trong quá trình tổng hợp pha rắn, cấu trúc cốt lõi được hình thành bằng cách liên kết axit amin đầu tiên với nhựa. Tiếp theo, axit amin tiếp theo được bổ sung theo trình tự và phản ứng hóa học với tác nhân ngưng tụ thích hợp. Cuối cùng, sản phẩm mục tiêu có thể thu được bằng cách tách polypeptit ra khỏi nhựa.
Tầm quan trọng của tổng hợp pha rắn là nó cho phép tự động hóa và sản xuất quy mô lớn tổng hợp peptide. Các phương pháp tổng hợp pha rắn chủ đạo hiện nay bao gồm Fmoc và Boc. Trong số đó, phương pháp Fmoc sử dụng nhóm bảo vệ N-Fmoc để bảo vệ peptide, trong khi phương pháp Boc sử dụng tert-butyloxycarbonyl để bảo vệ nhóm carboxyl.
Phương pháp hai, tổng hợp pha lỏng:
Tổng hợp pha lỏng là một phương pháp tổng hợp peptide truyền thống, trong đó các chất phản ứng được đặt trong pha lỏng cho phản ứng. Ưu điểm của tổng hợp pha lỏng là các điều kiện phản ứng nhẹ nhàng và phù hợp để biến đổi các cấu trúc hóa học nhạy cảm. Tuy nhiên, do có quá nhiều chất phản ứng nên quá trình tinh chế tương đối rườm rà. Các phản ứng hóa học trong tổng hợp pha lỏng bao gồm:
1. Phản ứng ngưng tụ:
Phản ứng ngưng tụ là một trong những phản ứng cơ bản nhất trong quá trình tổng hợp peptit, đó là nhóm cacboxyl được khởi xướng bởi các tác nhân ngưng tụ như DCC và HOBt được nối với nhóm amin của axit amin thông qua phản ứng acyl hóa. Các điều kiện phản ứng nhẹ và năng suất cao.
2. Phản ứng khử:
Phản ứng loại bỏ là khử methionine thành dithiol bằng NaBH4 và các chất khử khác, làm cho nó không hoạt động. Phản ứng cần tiến hành ở điều kiện cơ bản.
3. Loại bỏ nhóm bảo vệ:
Do chức năng khác nhau của các axit amin trong chuỗi peptit nên các nhóm bảo vệ khác nhau sẽ được sử dụng để bảo vệ. Sau khi quá trình tổng hợp hoàn tất, nhóm bảo vệ cần được loại bỏ. Đối với phương pháp Fmoc, piperidine thường được sử dụng để loại bỏ Fmoc; trong khi đối với phương pháp Boc, TFA được sử dụng để loại bỏ Boc.
Phương pháp ba, tổng hợp hóa học:
GLP-1 là một hormone polypeptide có các hoạt tính sinh học quan trọng. Sự tổng hợp của nó có thể được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó tổng hợp hóa học là một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến nhất. Ưu điểm của phương pháp tổng hợp hóa học là có thể tạo ra các sản phẩm mục tiêu có độ tinh khiết cao, thích hợp cho sản xuất quy mô lớn. Phương pháp tổng hợp hóa học và các bước chi tiết của GLP-1 sẽ được giới thiệu bên dưới.
1. Lộ trình tổng hợp và chọn nhóm bảo vệ:
Phân tử GLP-1 bao gồm 36 axit amin, trong đó có 21 axit amin loại L và 15 axit amin loại D. Trước khi tiến hành tổng hợp, cần chọn lộ trình tổng hợp phù hợp và tùy theo điều kiện tổng hợp mà chọn nhóm bảo vệ tương ứng. Tổng hợp pha rắn Fmoc thường được sử dụng để tổng hợp quy mô lớn tự động. Phương pháp này sử dụng chất bảo vệ N-9-fluoroimido carboxyl (N-Fmoc) làm nhóm bảo vệ và cũng cần chọn nhóm bảo vệ thứ cấp thích hợp (chẳng hạn như tert-butyl hoặc metyl) để đảm bảo khả năng bảo vệ các vị trí cụ thể. Mỗi khi một axit amin mới được thêm vào, nhóm bảo vệ Fmoc cần được loại bỏ trước, sau đó chất liên kết được bảo vệ của axit amin tiếp theo mới được thêm vào.
2. Tổng hợp trình tự axit amin lõi:
Trình tự cốt lõi của GLP-1 bao gồm 21 axit amin, bao gồm một serine chính và bốn trình tự dipeptide axit prolyl-glutamic. Trong tổng hợp pha rắn, quá trình tổng hợp trình tự lõi có thể được chia thành các bước sau:
2.1. Thêm axit axetic cacbamat (Fmoc-NH-CH2CO2Et) và 2-Cl-Trt-Cl vào nhựa tổng hợp pha rắn và thực hiện phản ứng ngưng tụ với tác nhân ghép DIC/NMM.
2.2. Loại bỏ nhóm bảo vệ Fmoc bằng cách khử nhóm phản ứng.
2.3. Thêm axit amin tiếp theo, lặp lại bước 1 và bước 2 theo trình tự cho đến khi chuỗi lõi được tổng hợp.
2.4. Sự hình thành cấu trúc pentapeptit trên nhựa pha rắn. Thêm thuốc thử acetalization vào nhựa pha rắn, phản ứng với chất nhận dạng đầu N (chẳng hạn như HBTU), thêm nhóm bảo vệ chuỗi bên của serine làm chất khử phụ trợ, sau đó loại bỏ nhóm bảo vệ Fmoc.
2.5. Dưới sự xúc tác của Bacillus subtilis transferase (ProTide), cấu trúc pentapeptide trải qua phản ứng trao đổi với tiền chất serine iodoacetate.
3. Tổng hợp trình tự axit amin còn lại:
Sau khi tổng hợp xong trình tự lõi, cần tiếp tục bổ sung các axit amin còn lại, bao gồm cả axit amin loại L và loại D. Việc bổ sung các axit amin này cần bắt đầu từ trình tự lõi, bổ sung axit amin tiếp theo theo trình tự và sử dụng tác nhân ngưng tụ tương ứng để thực hiện các phản ứng hóa học cho đến khi tổng hợp được phân tử polypeptide-1 GLP hoàn chỉnh. Trong quá trình này cũng cần chọn nhóm bảo vệ thích hợp theo yêu cầu, đồng thời thực hiện các bước phản ứng loại bỏ nhóm bảo vệ và bổ sung axit amin theo trình tự.
4. Xử lý natri hydroxit:
Sau khi tất cả các axit amin đã được thêm vào, một chuỗi peptit được tổng hợp chưa hoàn chỉnh được hình thành trên nhựa pha rắn và cần được xử lý để tạo thành một phân tử peptit hoàn chỉnh. Đầu tiên, peptide chưa tạo thành phải được thủy phân bằng natri hydroxit, sao cho nhóm carboxyl đầu C được gắn vào nhựa ban đầu được tách ra khỏi nhựa và nhóm bảo vệ được tách ra trong nước. Sau phản ứng thủy phân thu được sản phẩm mục tiêu.
5. Kết tủa và rửa:
Sau khi xử lý, dung dịch thủy phân được xử lý bằng axit để kết tủa sản phẩm mục tiêu. Tiếp theo, viên được tạo huyền phù lại trong nước, sau đó được rửa kỹ để loại bỏ tạp chất.
6. Thanh lọc:
Bước cuối cùng là tinh chế sản phẩm mong muốn, thường sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Trong quá trình này, độ tinh khiết của sản phẩm có thể được xác định bằng cách phát hiện đỉnh của dung dịch trong phổ khối. Nói tóm lại, quá trình tổng hợp hóa học của GLP-1 đòi hỏi nhiều vòng phản ứng phức tạp và quy trình tinh chế nghiêm ngặt để cuối cùng thu được sản phẩm mục tiêu hoạt động.
Phương pháp bốn, sinh tổng hợp:
GLP-1 là một hormone polypeptide quan trọng với nhiều tác dụng sinh lý khác nhau, bao gồm thúc đẩy bài tiết insulin, ức chế sự thèm ăn, giảm trọng lượng cơ thể và duy trì độ nhạy insulin, v.v. Phương pháp sinh tổng hợp GLP-1 chủ yếu được tổng hợp bởi các tế bào L trong tuyến tụy, và tốc độ tổng hợp của nó được điều chỉnh bằng chế độ ăn uống. Các bước chi tiết được giới thiệu như sau:
1. Công tác chuẩn bị trước khi tổng hợp:
Trước khi sinh tổng hợp GLP-1, cần phải thực hiện một số công việc chuẩn bị, bao gồm xác định loại tế bào được sử dụng, thiết lập các điều kiện nuôi cấy và chọn enzyme xúc tác thích hợp. Các tế bào L là nguồn tổng hợp GLP-1 chính vì chúng chứa tiền chất của hai loại hormone, GIP (peptide giống glucagon 1) và GLP-1. Tế bào L có thể được phân lập từ biểu mô ruột của thỏ hoặc chuột. Trước khi sinh tổng hợp, tế bào cần được nuôi cấy đủ số lượng, cung cấp đủ chất dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy phù hợp. Ngoài ra, cần chọn enzym xúc tác thích hợp để thúc đẩy phản ứng.
2. Tổng hợp, chế biến tiền chất:
Quá trình sinh tổng hợp GLP-1 chủ yếu xảy ra trong các tế bào L và tiền chất của nó bao gồm hai loại hormone, GIP và GLP-1. Sau khi đi vào các tế bào nội tiết, GIP và GLP-1 được xử lý bởi các enzym phân giải protein và phân cắt thành các peptit riêng lẻ. Một loạt các enzym và đồng yếu tố tham gia vào quá trình này, bao gồm tiền chất polypeptide acidase (PC2), isomerase và các yếu tố kết dính muộn.
3. Chuyển hóa lẫn nhau giữa các đoạn polipeptit:
Sau khi xử lý, các peptit GIP và GLP-1 được kết hợp lại để tạo thành polypeptit GLP-1. Quá trình này yêu cầu sử dụng peptit giống glucagon 1 (GLP-1) làm khuôn mà các peptit riêng lẻ khác được kết hợp để tạo thành polypeptit tổng hợp mới. Quá trình này cũng cần một số enzym và yếu tố cụ thể, bao gồm Prohormone Convertase 1/3 (PC1/3) và Carboxypeptidase E (CPE).
4. Bài tiết GLP-1:
Sau khi GLP-1 được tổng hợp và xử lý, nó được lưu trữ trong tế bào chất và các túi bên trong của các tế bào nội tiết. Khi được kích thích bởi chế độ ăn uống, các tế bào nội tiết giải phóng GLP-1 và đi vào hệ tuần hoàn máu thông qua các vi mạch. Quá trình này được điều chỉnh và kiểm soát thông qua một loạt các đường dẫn truyền tín hiệu, bao gồm cả cAMP-Ca2 cộngvà như thế.
Nói tóm lại, quá trình sinh tổng hợp GLP-1 bao gồm hoạt động chung của nhiều liên kết và yếu tố. Sự kết hợp giữa tổng hợp sinh học và tổng hợp hóa học có thể cung cấp nền tảng và hỗ trợ tốt hơn cho việc nghiên cứu và sản xuất GLP-1.
Phương pháp năm, tổng hợp enzyme:
Tổng hợp enzym là quá trình tổng hợp chuỗi peptit nhờ sự xúc tác của các enzym sinh học. So với các phương pháp tổng hợp pha lỏng truyền thống, quá trình tổng hợp enzyme có thể được thực hiện ở nhiệt độ phòng và có thể lựa chọn nhiều loại nguyên liệu thô. Các enzyme như theta-liquid synthase, AEP, ACE, v.v. thường được sử dụng để xúc tác cho quá trình tổng hợp.
Tóm lại, các phương pháp nêu trên là các phương pháp khả thi để tổng hợp GLP-1. Các phương pháp khác nhau phù hợp với các điều kiện thí nghiệm và môi trường sản xuất dược phẩm khác nhau.